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                組織、細胞到底該如何裂解?

                 更新時間:2019-03-26 點擊量:2786

                組織、細胞到底該如何裂解?

                實驗過程中難免會遇到特殊樣本比如組織和細胞,那我們我們又該如何來處理呢?常見的處理方法就是用RIPA來裂解。如發現 RIPA 有沉淀,請放室溫半小時或者常溫水浴使沉淀溶解。根據使用量,取每 1ml RIPA 加入 10ul PMSF,使 PMSF 的終濃度為 1mM,混勻備用(PMSF 現用現加)。

                1、樣品前處理:

                a)對于貼壁細胞:去除培養液,用 PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍。按照 6 孔板每孔細胞量加入

                150-250 ul 裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下,使裂解液和細胞充分接觸。

                b)對于懸浮細胞:離心收集細胞,按照 6 孔板每孔細胞量加入 150-250ul 裂解液的比例加入裂解液,用手

                指輕彈懸浮細胞以充分裂解。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多,必需分裝成 5-10×10 5 細

                胞/管,然后再裂解。

                c)對于組織樣品:把組織剪切成細小的碎片。按照每 20mg 組織加入 150-250ul 裂解液的比例加入裂解液

                (如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量) 。

                用玻璃勻漿器勻漿,直至充分裂解。

                2、后處理:

                將裂解后的樣品 10000-14000g 離心 3-5 分鐘,取上清,即可進行后續的蛋白濃度測定、SDS-PAGE、Western

                blotting 和免疫沉淀等操作。

                注意事項 :

                1、 使用本裂解液可以裂解細胞核,釋放出核蛋白的同時,也會將基因組一并釋放出來,造成細胞裂解液粘

                稠,此時可以直接加入蛋白上樣緩沖液煮沸再離心,離心后直接上樣電泳;若想測定濃度,可入加少量 SDS

                (1%),煮沸后離心測濃度。

                2、 本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑,所以不適合使用 Bradford 蛋白濃度測定試劑盒,請

                選擇 BCA 法或者 Lowry 法檢測蛋白濃度。

                3、 如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理打碎打散粘稠狀物,隨后離心取上清

                用于后續實驗。

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