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                豬細小病毒實時熒光PCR檢測試劑盒操作步驟

                 更新時間:2023-02-16 點擊量:661

                【產品名稱】

                通用名稱:豬細小病毒檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

                英文名稱Porcine pamovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

                【包裝規格】 25 T/& 50 T/

                【預期用途】

                本試劑盒利用實時熒光PCR原理,定性檢測豬細小病毒,對豬細小病毒引起的疾病診斷及療效評估有重要指導意義。

                【檢驗原理】

                本試劑盒針對豬細小病毒的高度保守區域設計特異性引物和探針,在反應體系中含豬細小病毒基因組模板的情況下,PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監測和輸出,實現檢測結果的定性分析。

                【主要組成成份】

                序號

                組成

                25 T/

                50 T/

                1

                PPV RT-PCR反應液

                437.5 μL×1

                875 μL×1

                2

                  PPV混合酶液

                 50 μL×1

                100 μL×1

                3

                  PPV陽性對照

                 40 μL×1

                 40 μL×1

                4

                  PPV陰性對照

                 40 μL×1

                 40 μL×1

                5

                說明書

                1

                1

                注:陰性對照為基因組DNA,陽性對照為經滅活處理的豬細小病毒核酸提取物。

                【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復凍融,有效期12個月。

                【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

                【樣本要求】

                1.70日齡以內流產胎兒、死胎、木乃伊胎及弱仔的腦、腎、睪丸、腸系膜淋巴結或母豬的胎盤、陰道分泌物和精液均可作為檢測病毒的材料。以腸系膜淋巴結和肝臟檢出率最高。

                2.血液或血清樣品:使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。

                3.肌肉或內臟樣品:取少量樣品(23克)于研缽或勻漿器中研磨,然后將研磨勻漿轉入無菌離心管中,3000 rpm 離心10分鐘取上清待檢。

                4.應避免標本間交叉污染。

                5.標本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于28℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標本應凍存-80以下,避免反復凍融。

                【檢驗方法】

                1. 試劑準備(試劑準備區)

                1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

                2)核算當次實驗所需要的反應數(n),并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

                n =陰性對照數(1T+陽性對照數(1T+誤差預留量(1T+樣本數

                單反液配制表(每份)

                RT-PCR反應液

                17.5 μL

                混合酶液

                 2.5 μL

                 (3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

                2.樣本準備(樣本處理區)

                QIAGEN、Roche公司病毒提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

                3.加樣

                在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉移到PCR儀器上。

                4. PCRPCR擴增區)

                1)取樣本處理區準備好的PCR反應管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,并記錄放置順序。

                2)按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。

                 


                反應體積

                25 μL

                通道選擇

                FAM通道采集豬細小病毒熒光信號

                PCR

                反應

                條件

                步驟

                條件

                循環數

                UNG

                    502分鐘(min

                1

                預變性

                95℃3分鐘(min

                1

                預擴增

                95℃5秒(s

                5

                55℃40秒(s

                PCR擴增

                95℃5秒(s

                40

                55℃40秒(s

                (此階段結束時采集熒光信號)

                 

                注:ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,設置淬滅基團選擇None。

                【參考值(參考范圍)】

                1.試劑盒有效性判定:

                 1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct≤35。

                 2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數增長期。

                2.標本結果判定:

                1陽性:標本檢測結果Ct≤35或有明顯指數增長期。

                2)可疑:標本檢測結果Ct值在3538范圍內。此時應對標本進行重復檢測,如重復實驗結果Ct值仍在3538范圍內,有明顯指數增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

                3)陰性:標本檢測結果Ct值>38或無Ct值。

                【檢驗結果的解釋】

                通道及檢測結果

                標本檢測結果解釋

                FAM

                陽性(+)

                標本中檢出豬細小病毒DNA

                陰性(-)

                標本中未檢出豬細小病毒DNA

                【檢驗方法的局限性】

                1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的di檢出shi可能會發生假陰性的結果。

                2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產生假陰性結果。

                3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發生交叉污染,則容易得到假陽性結果。

                【產品性能指標】 產品的di檢出限為102 Copies/mL,產品CV≤5%。

                【注意事項】

                1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進行操作,各區實驗服、儀器、耗材應獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區應配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進行操作;三個區應該配有紫外線殺菌裝置。

                2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理。

                3. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。

                4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時離心。

                5. 試劑盒內所配陰性和陽性對照在yi次使用前應全部轉移至標本準備區,并單獨存放。

                6. 為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進行任何標記。

                7. 儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置;不同批號試劑不能混用。

                8. ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。

                9. 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。

                 

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